Проучавање и вредновање карциногенезе

Карциногенеза се проучава различитим стандардизованим токсиколошким тестовима. Први део ових тестова спроводи се ин витро, и - ако су позитивни - настављамо са ин виво експериментисањем. Овај експериментални корак-по-корак приступ назива се ПРИСТУП ТАЧКА ОДЛУКЕ, низ испитивања која се заустављају на крају сваког испитивања како би се одлучило како ће се наставити са суђењем. Постоји пет фаза:

ФАЗА А: структура и карактеристике канцерогеног једињења;

ФАЗА: у овој фази краткотрајног ин витро тестирања користе се ћелије сисара. Најчешће коришћене ћелије су хепатоцити, јер се проучава степен поправљања оштећења које хепатоцит развија према озбиљности оштећења изазваног супстанцом. Укратко, не утврђујемо само оштећење, већ колико је система за поправку активирала ћелија јетре.

Спроведен поступак је формирање 3 културе хепатоцита. У првој култури хепатоцити су здрави, у другој се третирају испитиваном супстанцом и на крају у трећој се третирају контролном супстанцом која је свакако канцерогена.Ове три културе садрже радиоактивну базу пиримидина, која је тритирани тимидин, који делује као маркер.

Ако испитивано једињење изазове мутацију у ДНК, ћелија реагује на овај проблем активирањем система за поправку. Комад ДНК који је подвргнут мутацији је исечен и захваљујући дејству ДНКполимеразе недостајући део је замењен новим.За корекцију, ДНК полимераза користи нове базе, укључујући тритирани тимидин. Уграђена је радиоактивна база. Анализом радиоактивности одређује се ниво мутације у третираним ћелијама: што је већа радиоактивност, веће су мутације ДНК.

Такође у фази Б се такође врше тестови на бактеријама, како би се могло проучити постоје ли обрнуте мутације. Коришћене бактерије су већ носиоци мутација салмонеле. Мутација се тиче синтезе хистидина, па салмонеле не могу да расту без хистидина. Ове бактеријске колоније се делимично узимају за третирање испитиваном супстанцом, делимично за негативну контролу, а делимично за позитивну контролу, затим се тестирају са познатим канцерогеном. Ако је ова испитивана супстанца индиректна генотоксична, морају се унети метаболички ензими у медијум за културу. У овом тренутку постоје 3 културе које ће бити засејане и узгајане у петријевим посудама (нема хистидина у медијуму за културу). Ако није било мутација канцерогена за тестирање, теоретски их не би требало бити на плочама . Ако је дошло до мутагеног дејства канцерогена, можда је променио прву мутацију и створио другу мутацију способну за узгој бактерија на медијуму за културу без хистидина. У овом случају друга мутација којом се модификује прва мутација и узима назив РЕТРОМУТАЦИЈА Коначно, ако дође до значајног раста у пиаста петри, канцероген је директан.
Увек ин витро тестом је могуће одредити хромозомски интегритет. Овај тест се увек спроводи на ћелијама сисара и користи се за испитивање токсичних супстанци способних да изазову мутације на неким ензимима одговорним за биосинтезу ДНК. Супстанца која се тестира подвргава се ин витро анализи Да би се могло утврдити да ли испитивана супстанца утиче на интегритет и број присутних хромозома, користи се тест микронуклеуса. Микронуклеуси су везикуле које се формирају са делом хроматина у унутрашњости. Хроматин уграђен у ове микронуклеусе може бити или цео хромозом или фрагмент хромозома. Микронуклеуси су формирани погрешном ћелијском деобом, стварајући ћелије ћелије са генетским материјалом који није подједнако Резултат овог теста ће бити одређивање супстанци које су дефинисане кластогеним и вретенастим отровима. Кластогена супстанца производи микро језгре са центричним фрагментима хромозома па супстанца изазива лом хромозома, уместо да отровна супстанца вретена производи микронуклеуси који се унутар њега налазе читави хромозоми.
Ако супстанца која се испитује изазове генотоксичност у једном или више тестова, то се дефинише као високо сумњиво, па прелази директно у фазу Д. Ако, с друге стране, испитивана супстанца нема генотоксични ефекат, прелази се у фазу испитивања Ц јер може бити промотер.

ФАСЕЦ: у овој фази могу се обавити и ин витро и ин виво тестови.

За ин витро тестове, могло би се показати могућност да промоторска супстанца прекине јаз-спојеве између нормалних ћелија и туморских ћелија, са последичним проласком супстанци између две ћелије.

Ин виво тест је индукција тумора коже код мишева. Супстанца која се тестира наноси се два или три пута недељно на кожу миша. У року од 2/3 месеца, ако је ова супстанца промотор, може доћи до формирања папилома. Код мишева се узимају у обзир два главна податка: број мишева погођених папилома и број папилома присутних на свакој животињи. Ако супстанца делује као промотер и развије тумор код леченог миша, то значи да је то заиста супстанца са промоторским ефектом.

Када се ови тестови заврше, прелазимо на дугорочне ин виво тестове.

ФАСЕД: у овој фази се тестирају сва једињења која се покажу мутагена и сва једињења која се не доказују мутагеним. Тестови који се могу извести су различити, од којих су неки тестови који се раде на јетри, плућима и на крају на дојци.

Тест јетре показује стварање не новоформираног тумора, већ неопластичног фокуса, дакле нечега што се спрема да постане тумор. Ћелије овог жаришта су већ атипичне ћелије, па су подвргнуте мутацији и спремају се да постану неопластичне ћелије. Након одређеног времена, захваљујући обдукционом прегледу, утврђује се формирање пре-неопластичних жаришта, израчунавањем броја и обима ових пре-неопластичних формација.

Плућни тест омогућава утврђивање аденома, који је „аномалија ћелија плућног ткива. Такође у овом случају, плућно ткиво пацова се прегледа након прилично дугог времена (месеци) (ови аденоми се лако могу идентификовати јер су беличасти чворови на епителуму плућа).
Тест дојке омогућава одређивање тумора у жлезданом ткиву. Увек се процењује број формираних аденома и број животиња са аденомима.

Ако постоје позитивни резултати ових тестова, испитивана супстанца је заиста канцерогена. На овом месту прелазимо на извођење скупих тестова са веома дугим временима извођења.

ФАЗА: у овој фази се променљив број животиња, од 20 до 50, подвргава дуготрајним тестовима.Ови тестови су веома скупи и потребно је много времена да се добију одређени резултати; говоримо о око 1/8 живота животиње Могуће је да током процеса ових тестова неке животиње угину, али се увек проучавају обдукцијом и прегледом хистолошког типа. Изабране животиње су увек пацови и мишеви и само 70-80% преживи до краја дугорочних тестова. Коришћене животиње се управо одбијају, што су млађе, све су осетљивије на третмане. Током дугорочног периода испитивања, истраживачу увек помаже математичар-статистичар, способан да узме у обзир све прикупљене информације и да репродукује различите податке.

Дозе тестиране на животињама полазе од максимално толерисане дозе и свих њених вишеструких мултипликатора, а процењује се и реакција на дозу код животиње.
Администрација мора увек да се приближи путу којим мушкарац може доћи у додир са супстанцом која се испитује, дакле оралним, кожним или респираторним путем, док је, ако се испита канцерогеност лека, такође корисно извршити интравенозну примену.
Групе тестираних животиња су 4 (по 50 животиња за сваку групу):

НАИФ група која нема третман;
Група третирана возилом;
Група третирана испитиваном супстанцом;
Група третирана познатим канцерогеном.

Веома је важно да број животиња у свакој групи буде што је могуће једнак.У ствари, ако постоји превелика разлика у броју животиња, статистички тест може се показати лажним.
Евалуације које се спроводе су:

Укупна учесталост тумора;
Учесталост неких тумора;
Учесталост животиња са више од једне врсте тумора;
Број карцинома животиња.

На крају свих ових фаза испитивања, супстанца је класификована у ранг листи коју су утврдили ИАРЦ (Међународна агенција за истраживање и развој рака) и Агенција за заштиту животне средине (ЕПА).